مجله دانشکده پزشکی

زمینه و هدف: پلاسمینوژن انسانی یک گلیکوپروتیین پلاسمایی است که به طور عمده در کبد سنتز می‌شود. فعال شدن پلاسمینوژن به پلاسمین، توسط فعال کننده‌های پلاسمینوژن یکی از رویدادهای کلیدی سامانه فیبرینولیتیک انسان است. در این مطالعه ما اثرات دو آنتی‌بادی منوکلونال ضد پلاسمینوژن انسانی، A1D12 و MC2B8 را بر فعال شدن گلو- پلاسمینوژن در حضور فعال کننده‌های نوع بافتی (t-PA) و نوع ادراری پلاسمینوژن (u-PA) و همچنین استرپتوکیناز بررسی نمودیم.
روش بررسی: تولید آنتی‌بادی‌های دو رگه به وسیله ادغام سلول‌های طحال موش BALB/C ایمونیزه شده با گلو- پلاسمینوژن انسانی با سلول‌های میلومای NS1، طبق روش Kohler و Milstein انجام شد. فعال شدن پلاسمینوژن با اندازه‌گیری تولید پلاسمین با استفاده از سوبسترای رنگزای S-2251 سنجش شد. پس از آن اثر آنتی‌بادی‌های منوکلونال، A1D12 و MC2B8، بر فعال شدن پلاسمینوژن در محلول ارزیابی گردید. سرعت‌های اولیه و شاخص‌های کینتیکی فعال شدن پلاسمینوژن در حضور آنتی‌بادی‌های منوکلونال نیز محاسبه گردید. اثر آنتی‌بادی منوکلونال MC2B8 بر سرعت هیدرولیز پلاسمین سنجش شد. همچنین اثر بخش F(ab&apos)₂ آنتی‌بادی A1D12 بر فعال شدن پلاسمینوژن انسانی به وسیله u-PA با اثر آنتی‌بادی کامل بر این واکنش مقایسه شد.
یافته‌ها: آزمون ELISA نشان داد که آنتی‌بادی‌ها به خوبی با آنتی‌ژن واکنش پذیری دارند. آنتی‌بادی A1D12 سرعت ماکزیمم (V_max) فعال شدن پلاسمینوژن به وسیله هر یک از سه فعال کننده را افزایش و آنتی‌بادی MC2B8 آن را کاهش داد. در تمامی واکنش‌های فعال شدن، مقدار K_m فعال شدن پلاسمینوژن در حضور آنتی‌بادی A1D12 تغییر چندانی نکرد در حالی که آنتی‌بادی MC2B8 مقدار K_m فعال شدن به وسیله u-PA، t-PA وابسته به منومر فیبرین و استرپتوکیناز را کاهش داد. آنتی‌بادی منوکلونال MC2B8 اثر قابل ملاحظه‌ای بر سرعت هیدرولیز سوبسترای سنتزی S-2251 توسط پلاسمین نداشت. سرعت فعال شدن پلاسمینوژن به وسیله u-PA در حضور غلظت‌های پایین‌تری از بخش F(ab)₂ آنتی‌بادی A1D12 برابر با آنتی‌بادی کامل است.
نتیجه‌گیری: اتصال آنتی‌بادی A1D12 از ناحیه F(ab) خود به گلو- پلاسمینوژن، کارآیی کاتالیتیکی فعال شدن پلاسمینوژن به وسیله فعال کننده‌های پلاسمینوژن را افزایش می‌دهد. بنابراین به لحاظ کلینیکی به کارگیری آنتی‌بادی A1D12 برای درمان رویدادهای انسدادی عروق نظیر سکته قلبی، با انسانی نمودن بخش F(ab) آنتی‌بادی A1D12 ممکن است مفید باشد. الگوی مهاری آنتی‌بادی MC2B8، با اتصال احتمالی به جایگاه برش گلوتامین- پلاسمینوژن یا نزدیک آن، از نوع مهار آنزیمی چندگانه می‌باشد.

استرپتوکیناز (SK) یک داروی ویژه و موثر در درمان ترومبولیتیک سکته‌های حاد قلبی می‌باشد. علی‌رغم وجود محدودیت‌های قابل توجه، به‌دلیل قیمت نسبتا˝ پایین استرپتوکیناز این پروتئین هنوز یک داروی انتخابی به‌ویژه در کشورهای کم‌درآمد می‌باشد. در بررسی حاضر، تولید و تخلیص استرپتوکیناز با استفاده از وکتور بیانی pMAL مورد ارزیابی قرار گرفته است.
روش بررسی: ابتدا پلاسمید pMAL که حاوی ژن skc (بدست‌آمده از Streptococcus equisimilis H46A) بود، به میزبان مناسب (E.coli BL21) انتقال یافت. در مرحله بعد شرایط تولید استرپتوکیناز از نظر دما، غلظت‌های مختلف IPTG به‌عنوان القاﺀگر و نیز مدت زمان القاﺀ بهینه‌سازی شد. این پروتئین با استفاده از ستون کروماتوگرافی DEAE-Sepharose خالص‌سازی شده و در نهایت خلوص و فعالیت آن تعیین گردید.
یافته‌ها: پس از بهینه‌سازی شرایط تولید، قسمت عمده پروتئین تام باکتری متعلق به SK-MBP (اسرپتوکیناز-پروتئین متصل‌شونده به مالتوز) گردید. SK-MBP خالص‌شده بر روی ژل SDS-PAGE یک باند تک را نشان داد. فعالیت بیولوژیکی SK-MBP خالص‌شده در حضور پلاسمینوژن با استفاده از سوبسترای سنتتیک (S2251) اندازه‌گیری شد که نشان‌دهنده فعالیت بالای آن بود.
نتیجه‌گیری: در این مطالعه از وکتور بیانی pMAL که پروتئین فیوژن محلول (SK-MBP) را در E.coli BL21 تولید می‌کند استفاده کرده‌ایم. با استفاده از این روش، علی‌رغم بیان بالای SK-MBP، از تشکیل Inclusion body جلوگیری شد. انتخاب میزبان مناسب برای تولید پروتئین‌های نوترکیب یکی از مهمترین فاکتورهایی است که بر روی سطح بیان پروتئین مورد نظر تاثیر می‌گذارد. پیشنهاد می‌شود از میزبان‌های دیگر نیز برای این منظور استفاده شود.