مجله دانشکده پزشکی

---

زمینه و هدف: پلاسمینوژن انسانی یک گلیکوپروتیین پلاسمایی است که به طور عمده در کبد سنتز می‌شود. فعال شدن پلاسمینوژن به پلاسمین، توسط فعال کننده‌های پلاسمینوژن یکی از رویدادهای کلیدی سامانه فیبرینولیتیک انسان است. در این مطالعه ما اثرات دو آنتی‌بادی منوکلونال ضد پلاسمینوژن انسانی، A1D12 و MC2B8 را بر فعال شدن گلو- پلاسمینوژن در حضور فعال کننده‌های نوع بافتی (t-PA) و نوع ادراری پلاسمینوژن (u-PA) و همچنین استرپتوکیناز بررسی نمودیم.
روش بررسی: تولید آنتی‌بادی‌های دو رگه به وسیله ادغام سلول‌های طحال موش BALB/C ایمونیزه شده با گلو- پلاسمینوژن انسانی با سلول‌های میلومای NS1، طبق روش Kohler و Milstein انجام شد. فعال شدن پلاسمینوژن با اندازه‌گیری تولید پلاسمین با استفاده از سوبسترای رنگزای S-2251 سنجش شد. پس از آن اثر آنتی‌بادی‌های منوکلونال، A1D12 و MC2B8، بر فعال شدن پلاسمینوژن در محلول ارزیابی گردید. سرعت‌های اولیه و شاخص‌های کینتیکی فعال شدن پلاسمینوژن در حضور آنتی‌بادی‌های منوکلونال نیز محاسبه گردید. اثر آنتی‌بادی منوکلونال MC2B8 بر سرعت هیدرولیز پلاسمین سنجش شد. همچنین اثر بخش F(ab&apos)₂ آنتی‌بادی A1D12 بر فعال شدن پلاسمینوژن انسانی به وسیله u-PA با اثر آنتی‌بادی کامل بر این واکنش مقایسه شد.
یافته‌ها: آزمون ELISA نشان داد که آنتی‌بادی‌ها به خوبی با آنتی‌ژن واکنش پذیری دارند. آنتی‌بادی A1D12 سرعت ماکزیمم (V_max) فعال شدن پلاسمینوژن به وسیله هر یک از سه فعال کننده را افزایش و آنتی‌بادی MC2B8 آن را کاهش داد. در تمامی واکنش‌های فعال شدن، مقدار K_m فعال شدن پلاسمینوژن در حضور آنتی‌بادی A1D12 تغییر چندانی نکرد در حالی که آنتی‌بادی MC2B8 مقدار K_m فعال شدن به وسیله u-PA، t-PA وابسته به منومر فیبرین و استرپتوکیناز را کاهش داد. آنتی‌بادی منوکلونال MC2B8 اثر قابل ملاحظه‌ای بر سرعت هیدرولیز سوبسترای سنتزی S-2251 توسط پلاسمین نداشت. سرعت فعال شدن پلاسمینوژن به وسیله u-PA در حضور غلظت‌های پایین‌تری از بخش F(ab)₂ آنتی‌بادی A1D12 برابر با آنتی‌بادی کامل است.
نتیجه‌گیری: اتصال آنتی‌بادی A1D12 از ناحیه F(ab) خود به گلو- پلاسمینوژن، کارآیی کاتالیتیکی فعال شدن پلاسمینوژن به وسیله فعال کننده‌های پلاسمینوژن را افزایش می‌دهد. بنابراین به لحاظ کلینیکی به کارگیری آنتی‌بادی A1D12 برای درمان رویدادهای انسدادی عروق نظیر سکته قلبی، با انسانی نمودن بخش F(ab) آنتی‌بادی A1D12 ممکن است مفید باشد. الگوی مهاری آنتی‌بادی MC2B8، با اتصال احتمالی به جایگاه برش گلوتامین- پلاسمینوژن یا نزدیک آن، از نوع مهار آنزیمی چندگانه می‌باشد.

---

استرپتوکیناز (SK) یک داروی ویژه و موثر در درمان ترومبولیتیک سکته‌های حاد قلبی می‌باشد. علی‌رغم وجود محدودیت‌های قابل توجه، به‌دلیل قیمت نسبتا˝ پایین استرپتوکیناز این پروتئین هنوز یک داروی انتخابی به‌ویژه در کشورهای کم‌درآمد می‌باشد. در بررسی حاضر، تولید و تخلیص استرپتوکیناز با استفاده از وکتور بیانی pMAL مورد ارزیابی قرار گرفته است.
روش بررسی: ابتدا پلاسمید pMAL که حاوی ژن skc (بدست‌آمده از Streptococcus equisimilis H46A) بود، به میزبان مناسب (E.coli BL21) انتقال یافت. در مرحله بعد شرایط تولید استرپتوکیناز از نظر دما، غلظت‌های مختلف IPTG به‌عنوان القاﺀگر و نیز مدت زمان القاﺀ بهینه‌سازی شد. این پروتئین با استفاده از ستون کروماتوگرافی DEAE-Sepharose خالص‌سازی شده و در نهایت خلوص و فعالیت آن تعیین گردید.
یافته‌ها: پس از بهینه‌سازی شرایط تولید، قسمت عمده پروتئین تام باکتری متعلق به SK-MBP (اسرپتوکیناز-پروتئین متصل‌شونده به مالتوز) گردید. SK-MBP خالص‌شده بر روی ژل SDS-PAGE یک باند تک را نشان داد. فعالیت بیولوژیکی SK-MBP خالص‌شده در حضور پلاسمینوژن با استفاده از سوبسترای سنتتیک (S2251) اندازه‌گیری شد که نشان‌دهنده فعالیت بالای آن بود.
نتیجه‌گیری: در این مطالعه از وکتور بیانی pMAL که پروتئین فیوژن محلول (SK-MBP) را در E.coli BL21 تولید می‌کند استفاده کرده‌ایم. با استفاده از این روش، علی‌رغم بیان بالای SK-MBP، از تشکیل Inclusion body جلوگیری شد. انتخاب میزبان مناسب برای تولید پروتئین‌های نوترکیب یکی از مهمترین فاکتورهایی است که بر روی سطح بیان پروتئین مورد نظر تاثیر می‌گذارد. پیشنهاد می‌شود از میزبان‌های دیگر نیز برای این منظور استفاده شود.

---

زمینه و هدف: در سال‌های اخیر آنتی‌بادی‌های کاتالیتیک مختلفی در افراد مبتلا به بیماری‌های خود ایمن یافت شده‌اند، به علاوه وجود آنتی‌بادی‌های مختلف با فعالیت DNase و RNase در شیر و سرم مادران سالم گزارش گردیده است. در این مطالعه به بررسی وجود آنتی‌بادی‌هایی با فعالیت پروتئولیتیک پرداخته شده است.
روش بررسی: آنتی‌بادی‌های موجود در سرم 30 خانم باردار در سه ماهه اول بارداری و 10 فرد کنترل توسط کروماتوگرافی تمایلی و ژل فیلتراسیون خالص‌سازی شدند. همگی خانم‌ها اولین بارداری خود را سپری می‌کردند و کلیه نمونه‌ها شامل افراد باردار و کنترل در محدوده سنی 25 تا 35 سال قرار داشتند. سپس به بررسی بهترین شرایط از نظر بافر، دما و pH برای مشاهده فعالیت پروتئازی پرداخته شد. فعالیت پروتئازی این آنتی‌بادی‌ها توسط زیموگرافی در ژل حاوی سوبسترای ژلاتین نشان داده شد.
یافته‌ها: نتایج حاصل از تیمار آنتی‌بادی‌ها در شرایط مناسب نشان داد که تعدادی از نمونه‌های آنتی‌بادی افراد باردار فعالیت آنزیمی دارند. داده‌های حاصل از بررسی زیموگرام وجود فعالیت پروتئازی در نمونه‌های مربوطه را تایید کرد. انجام وسترن بلات تایید کرد که قطعات ایجاد شده ناشی از هیدرولیز خود آنتی‌بادی‌ها بوده و آلودگی پروتئینی نمی‌باشند.
نتیجه‌گیری: به علت شرایط خاص سیستم ایمنی در خانم‌های باردار، آنزیم‌هایی با فعالیت‌های آنزیمی مختلف می‌توانند تولید شوند. در رابطه با نقش احتمالی این آبزیم‌ها می‌توان گفت ممکن است چنین آنتی‌بادی‌هایی با فعالیت پروتئولیتیک در حذف مستقیم آنتی‌ژن‌ها از خون نقش داشته باشند. 

---

زمینه و هدف: سلول‏های سرطانی برای رشد و تقسیم به غذا نیازمندند. بنابراین برای درمان سرطان یکی از روش‏های مهم و امیدوار کننده استفاده از مهارکننده‏های رگزایی است که رشد تومور و متاستاز سلول‏های سرطانی را متوقف می‏کنند. مطالعات قبلی نشان می‏دهد که Plasminogen related protein-B دارای اثرات ضد توموری است. با توجه به شباهت این پپتید با Preactivation peptide پلاسمینوژن (PAP)، اثرات ضد رگزاییPAP  در مدلی آزمایشگاهی مورد مطالعه قرار گرفت.
روش بررسی: قطعه  DNA بیان‌کننده PAP به کمک PCR از ژن پلاسمینوژن انسانی در حامل pGEX-2T همسانه‌سازی شد و در باکتری Escherichia coli به صورت متصل با GST (Glutathione S-transferase) بیان گردید، سپسRefolding  پروتئین حاصل (GST-PAP) انجام گرفت و پروتئین مذکور با رزینGSH-Sepharose  تخلیص شد و روی یک مدل رگزایی با استفاده از ماتریژل بررسی گردید.
یافته ‏ها: پس از تایید صحت پروتئین خالص شده با روش‏های
SDS-PAGE و ایمنوبلاتینگ، بر اساس نتایج حاصل از سنجش رگزایی در سیستم ماتریژل مشخص شد که GST-PAP رگزایی را متوقف و مهار می‏کند. طبق این اطلاعات همبستگی بسیاری بین غلظت اعمال شده از GST-PAP و مهار رگزایی وجود دارد که به صورت کاهش طول ساختارهای مویرگی شکل و تعداد توبول‏ها مشخص می‏شود. مهار رگزایی در غلظت‌های بالای 25 میکروگرم در میلی‌لیتر نسبت به کنترل معنی‏دار هستند.
نتیجه‌گیری: براساس یافته‌های این مطالعه
 GST-PAP در سیستم ماتریژل توانایی مهار تشکیل شبکه سلول‏های آندوتلیال‏ را داراست. این نتایج می‏تواند تاییدی برای فرضیه مهار رگزایی توسط PAP باشد. لذا این پپتید می‏تواند نامزدی برای مهار رگزایی محسوب شود.

---

زمینه و هدف: پلاسمینوژن توسط یک‌سری فعال‌کننده‌ها (PAs) به آنزیم فعال پلاسمین تبدیل می‌شود و نقش خود را که انحلال لخته فیبرینی است به‌انجام می‌رساند. سیستم فیبرینولیز همچنین در فرآیند آنژیوژنز نیز دارای نقش اساسی می‌باشد. فعالیت سیستم فیبرینولیز از طریق پروتئولیز با واسطه فیبرین، مهاجرت و تهاجم سلولی را کنترل می‌کند. به‌علاوه آنزیم پلاسمین رشد تومور و متاستاز را تنظیم می‌کند. آنتی‌بادی‌های منوکلونال به‌عنوان ابزارهای بیولوژیک کارآمد نقش مهمی را در تحقیقات بنیادین ایفاء می‌کنند.

روش بررسی: نخست به روش‌های مختلف چشمی، سنجش کمی قطعات DD/E به‌روش D- دایمر و استفاده از سوبسترای کروموژنیک S-2251 (روش الیزا)، تأثیر آنتی‌بادی‌ها بر فعالیت سیستم فیبرینولیز در حضور فعال‌کننده‌ها بررسی شد. در مرحله بعد اثر آنتی‌بادی‌ها بر فرآیند آنژیوژنز در یک مدل رگزایی در شرایط آزمایشگاهی مورد ارزیابی قرار گرفت.

یافته‌ها: نتایج حاصله نشان داد که آنتی‌بادی MC2B8 که مهارکننده فعالیت پلاسمینوژن در حضور فعال‌کننده‌های پلاسمینوژن است، بر فرآیند رگزایی نیز اثر مهاری دارد. A1D12 که یک آنتی‌بادی علیه بخش N- ترمینال پلاسمینوژن است علاوه بر تسریع فعالیت سیستم فیبرینولیز در حضور فعال‌کننده‌ها، باعث فعال شدن فرآیند آنژیوژنز در شرایط آزمایشگاهی می‌شود.

نتیجه‌گیری: تشکیل پلاسمین یک مرحله کلیدی در تهاجم و مهاجرت سلول‌های اندوتلیال جهت تشکیل عروق خونی است. پلاسمین به‌طور مستقیم توسط تجزیه ماتریکس فیبرینی و دیگر ماتریکس‌ها و به‌طور غیرمستقیم توسط فعال کردن ماتریکس متالوپروتئازها و فاکتورهای رشد رگزایی در رگزایی نقش دارد. بر طبق نتایج آزمایشگاهی به‌دست آمده آنتی‌بادی‌های منوکلونال MC2B8 و A1D12 در یک حالت وابسته به دوز در این فرایند نقش دارند.

---

800x600 Normal 0 false false false EN-US X-NONE AR-SA MicrosoftInternetExplorer4

زمینه و هدف: سلول‌‌های سرطانی، صرف‌نظر از نوع و منشأ آن‌ها هورمون گنادوتروپین جفتی انسان (hCG)، زیرواحدها و مشتقات آن را بیان می‌کنند، ظاهراً hCG، فنوتیپ مشترک رده سلول‌های سرطانی انسان است. در این تحقیق اثر آنتی‌بادی‌های منوکلونال ضد hCG (7D9، T18H7 و T8B12) روی سلول‌های سرطانی انسان بررسی شد.

روش بررسی: هیبریدوماهای ترشح‌کننده آنتی‌بادی‌های منوکلونال 7D9، T18H7 و T8B12 تکثیر و به موش‌های Balb/C به‌صورت داخل صفاقی تزریق شدند. تخلیص آنتی‌بادی‌ها از مایع آسیت، با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی پروتیین G- سفارز و سپس تعویض یونی انجام گرفت. SDS-PAGE و الایزا به‌ترتیب ساختار و عملکرد آنتی‌بادی‌ها را تأیید کرد. دو رده سلول سرطانی انسان "Hela و "MDA، توسط آنتی‌بادی‌های تخلیص شده، تیمار شدند. سه روز بعد، از چاهک‌ها، میکروگراف تهیه گردید و سپس شمارش سلولی انجام شد. 

یافته‌ها: ژل غیراحیایی SDS-PAGE نشان داد که الگوی مهاجرت باندها با آنتی‌بادی کنترل، مطابقت دارد. تست الایزا با آنتی‌ژن مربوطه (hCG) نشان داد که آنتی‌بادی‌های تولیدشده قادر به تشخیص آنتی‌ژن hCG هستند. شمارش سلولی و تصاویر میکروسکوپی از چاهک‌های مختلف تیمارشده، ثابت کرد که از بین آنتی‌بادی‌های مورد مطالعه، آنتی‌بادی 7D9 اثرات سیتوتوکسیک روی سلول‌های مورد مطالعه دارد.

 نتیجه‌گیری: آنتی‌بادی‌های منوکلونال ضد hCG می‌توانند در تیمار هدفمند سرطان استفاده شوند؛ چون سلول‌های سرطانی، ژن hCG را بیان می‌کنند. آنتی‌بادی 7D9 که فعالیت پروتئازی دارد، کاندیدای مناسبی برای این هدف است؛ چون هم خاصیت خنثی کردن عملکرد hCG و هم خاصیت آنزیمی دارد.